Впервые технология редактирования генов CRISPR-Cas9 была использована в модели целого организма для систематического нацеливания на каждый ген в геноме. Команда ученых из Института Броуда и Дэвида Х. из Массачусетского технологического института. Институт интегративных исследований рака Коха впервые применил эту технологию для "Вырубить," или выключить, все гены в геноме систематически в животной модели рака, выявляя гены, участвующие в эволюции и метастазировании опухоли, и прокладывая путь для аналогичных исследований на других типах клеток и болезнях. Работа появится в сети 5 марта в Cell.
"Библиотеки РНК в масштабе генома – это мощная система скрининга, и мы рады начать применять ее для изучения функции генов на моделях животных," – сказал соавтор исследования Фэн Чжан, главный сотрудник Института Броуда Массачусетского технологического института и Гарварда, исследователь из Института исследований мозга Макговерна при Массачусетском технологическом институте и доцент кафедры мозга и когнитивных наук и биологической инженерии Массачусетского технологического института. "Это исследование представляет собой первый шаг к использованию Cas9 для идентификации важных генов рака и других сложных заболеваний in vivo."
"Эволюция опухоли – это чрезвычайно сложный набор процессов или признаков, контролируемых сетями генов," сказал соавтор исследования Филип Шарп, профессор института Массачусетского технологического института, член правления Института Броуда и член Института Коха. "Применение редактирования генов in vivo представляет собой мощную платформу для функциональных геномных открытий, предлагая новые средства для исследования каждого этапа эволюции опухоли и определения генов, регулирующих эти признаки."
Технология редактирования генов CRISPR-Cas9 позволяет ученым исследовать роль генов и генетических мутаций в биологии человека и болезнях. Система может устранить функцию генов на уровне ДНК по сравнению с другими генетическими нарушениями, такими как вмешательство РНК, которое "сбить" гены на уровне РНК. Ученые из Института Броуда ранее проводили полногеномный скрининг с использованием технологии CRISPR-Cas9 в клеточных моделях, но этот подход не отражает сложных процессов, происходящих во всем организме. Например, чтобы рак дал метастазы, злокачественные клетки должны покинуть первичную опухоль, войти в кровеносные сосуды, чтобы добраться до удаленного участка тела, покинуть кровеносные сосуды и развиваться в новой среде. Чжан и Шарп объединились для поиска генов, участвующих в метастазировании, применив технологию CRISPR-Cas9 на модели целого животного.
В новом исследовании клетки мышиной модели немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) обрабатывали объединенной библиотекой CRISPR-направляющих РНК Броада, нацеленной на каждый ген в геноме мыши, известной как "нокаут-библиотека CRISPR в масштабе генома мыши A" (mGeCKOa) вместе с ферментом, расщепляющим ДНК Cas9. Система вводит мутации в определенные гены, нарушая их последовательность и предотвращая производство белков из этих генов. Такой подход гарантировал, что в каждой клетке был отключен только один ген, и что все гены в геноме мыши были нацелены на гетерогенную популяцию клеток в культуре. Затем исследователи трансплантировали клетки мыши и обнаружили, что клетки, обработанные нокаут-библиотекой, образуют высокометастатические опухоли.
Используя секвенирование следующего поколения, ученые смогли определить, какие гены были отключены в первичных опухолях и в метастазах, что указывает на то, что эти гены, вероятно, являются супрессорами опухоли, которые обычно подавляют рост опухоли, но при отключении способствуют ему.
Результаты выявили некоторые хорошо известные гены-супрессоры опухолей при раке человека, включая Pten, Cdkn2a и Nf2, но включали некоторые гены, ранее не связанные с раком. Неожиданно скрининг также выявил несколько микроРНК – небольших сегментов РНК, которые функционируют в клетке.
Остается еще больше экспериментальной работы, чтобы полностью изучить гены и микроРНК, обнаруженные на экране. Метастатические опухоли редко биопсируются в клинике, что делает мало образцов для исследований, но будущее включение метастазов в исследования по секвенированию рака позволит лучше понять результаты этого исследования.
Исследователи могут использовать тот же подход in vivo, который описан в статье о клетках, для изучения эффектов сверхэкспрессии генов, для скрининга циркулирующих опухолевых клеток или других клеточных линий, а также для изучения других фенотипов рака, таких как раковые стволовые клетки, взаимодействия хозяина и окружающей среды. , и ангиогенез.
"Наша работа представляет собой доказательство принципа нокаута-скрининга in vivo для идентификации генов, регулирующих различные пути и этапы эволюции опухоли," сказал Сиди Чен, соавтор и научный сотрудник лаборатории Sharp.
В исследовании также использовалась эффективная многоуровневая стратегия скрининга, в которой меньший, более сфокусированный пул направляющих РНК используется для проверки лучших совпадений генов. "После беспристрастного скрининга на весь геном мы разработали библиотеку подпула, чтобы быстро протестировать гораздо больше целей, чем это было бы возможно при нацеливании на отдельные гены у отдельных мышей," сказал Невилл Санджана, соавтор и научный сотрудник лаборатории Чжана. "Подпул также позволяет нам увидеть, как эти разные генетические мутации конкурируют в одной и той же опухоли."