В 2005 году ученый из Стэнфордского университета открыл, как включать и выключать клетки мозга световыми импульсами, используя специальные белки микробов для передачи электрического тока в нейроны.
С тех пор исследовательские группы по всему миру использовали технику, которую этот ученый Карл Дайссерот, доктор медицинских наук, назвал "оптогенетика" изучать не только клетки мозга, но и клетки сердца, стволовые клетки и широкий спектр типов клеток в биологии, которые могут регулироваться электрическими сигналами – движение ионов через клеточные мембраны.
Оптогенетика дала исследователям мощную исследовательскую технику, которая позволила им глубже понять устройство и функционирование биологических систем на моделях животных. Но у оптогенетики первого поколения был недостаток: его светочувствительные белки были мощными при включении клеток, но менее эффективны при их выключении.
Теперь, в статье, ставшей кульминацией многолетних усилий, команда Дейссерота модернизировала свои светочувствительные белки, чтобы выключать клетки гораздо эффективнее, чем раньше. Статья будет опубликована 25 апреля в журнале Science.
"Это то, что мы и другие специалисты в этой области очень долго искали," сказал Дейссерот, старший автор статьи и профессор биоинженерии, психиатрии и поведенческих наук.
Томас Инсел, доктор медицины, директор Национального института психического здоровья, финансировавшего исследование, сказал, что это улучшило "выключенный" переключатель поможет исследователям лучше понять мозговые цепи, участвующие в поведении, мышлении и эмоциях.
"Это последнее открытие команды Дейссерота представляет собой разновидность нейротехнологии, которую предвидел президент Обама, когда год назад запустил инициативу BRAIN," Инсель сказал. "Он создает мощный инструмент, который позволяет нейробиологам применять тормоз в любой конкретной цепи с точностью до миллисекунды, что выходит за рамки возможностей любой существующей технологии."
За этой разработкой стояли многолетние фундаментальные эксперименты в лаборатории Деиссерота, чтобы обнаружить, как ключевой оптогенетический "на" переключатель работал так эффективно, чтобы стимулировать клетки, после чего последовали систематические усилия по перепроектированию этой молекулярной машины, чтобы превратить ее в принципиально новый вид "выключенный" выключатель.
"Это сложная история на стыке науки и техники," сказал Дейссерот, который также является D.ЧАС. Чен, профессор Стэнфордского университета и исследователь Медицинского института Говарда Хьюза.
Белки – это механизм жизни. Эти гигантские молекулы состоят из более мелких молекул, известных как аминокислоты. Как и многие части Lego, аминокислоты соединяются, образуя белки, и эти белки затем взаимодействуют для выполнения всех чудесных жизненных задач, от управления мышцами на кончиках наших пальцев до возбуждения нейронов в нашем мозгу. С помощью оптогенетики лаборатория Дейссерота превратила семейство белков, известных как микробные опсины, в инструмент исследования. Эта история была рассказана в другом месте, но в результате оптогенетика позволила ученым запускать лазерные импульсы через тонкие оптоволоконные кабели, вставленные в мозг моделей животных. Эти световые импульсы запускали опсины для доставки стимулирующего потока положительных ионов или подавляющего импульса отрицательных ионов для управления поведением с высокой точностью и специфичностью.
По мере того, как все больше исследователей обращались к оптогенетике, многие открытия были сделаны с использованием как возбуждающих, так и ингибирующих опсинов. Но Дейссерот и другие ученые начали замечать, что стимуляция более эффективна, чем ингибирование. Поэтому он стремился заложить основу для разработки новых инструментов ингибирования, более глубоко погрузившись в механизм, с помощью которого возбуждающие опсины доставляют только положительные ионы.
Концептуально механизм действия возбуждающих опсинов прост. Световая активация заставляет опсин открывать канал через клеточную мембрану; положительные ионы затем текут через этот канал, как вода через садовый шланг. Воспользовавшись этим канальным механизмом, Дейссерот и его сотрудники в 2008 году создали модифицированные версии возбуждающих опсинов. Они назвали эти ступенчатые опсины. Достаточно одного светового импульса, чтобы включить эти переключатели и оставить канал открытым. Это позволяло ионам продолжать течь, что сохраняло ячейку в возбужденном состоянии даже после выключения света. Непрерывный поток ионов, обеспечиваемый этими ступенчатыми опсинами, также сделал клетку во много раз более светочувствительной. Это позволило ученым возбуждать нейроны глубоко внутри мозга моделей животных, не проникая в ткани с помощью оптоволоконных средств.
Напротив, ни один из ингибирующих опсинов не действовал как каналы. Они все были "насосы" перемещение только одного иона через мембрану для каждого входящего фотона – действуя больше как струйный пистолет, чем садовый шланг. Каждый входящий фотон походил на нажатие на спусковой крючок, чтобы доставить отрицательный ион. Но потребовался еще один фотон или нажатие на спусковой крючок, чтобы доставить следующий отрицательный ион, и так далее. Этот механизм накачки был менее эффективен, чем канальный, с точки зрения количества ионов, перемещаемых на фотон. Также было невозможно сконструировать ингибирующие опсины, чтобы они оставались открытыми. Поэтому для проведения экспериментов потребовалось более навязчивое использование света. Наконец, тормозной насос не работал так же, как обычные механизмы, подавляющие клетки мозга. Нормальные механизмы делают мембраны нейронов неплотными – как водяные шары с булавочными уколами – и делают их более устойчивыми к стрельбе. Все эти факторы сделали опсиновые насосы менее эффективными в качестве ингибиторов. В идеале биоинженеры хотели, чтобы опсин-ингибитор функционировал как канал.
В статье 2012 года в журнале Nature команда Дайссерота (с соавтором Осаму Нуреки, доктором философии, директором биологических наук Токийского университета) сделала первый большой шаг на пути к улучшению оптогенетического ингибирования, когда они раскрыли подробную структуру переключателя. белок канала. Эта работа показала, что аминокислоты внутри поры канала создают слой отрицательных зарядов. Эта отрицательная подкладка привлекала положительные ионы, которые проходили через мембрану, чтобы возбуждать клетку. Это открытие указывало на потенциальную стратегию создания тормозного канала: биоинженерия опсина для создания внутренней выстилки из положительных аминокислот для втягивания потока отрицательных (ингибирующих) ионов, таких как хлорид, в клетку.
С этого момента команде Дейссерота во главе с Андре Берндтом, доктором философии, и Су Юн Ли, доктором наук, докторантами в области биоинженерии и ведущими авторами статьи, потребовалось еще примерно два года, чтобы завершить этот процесс. Чтобы создать эту новую подкладку, команда Стэнфорда модернизировала опсин возбуждающего канала из своего эксперимента 2012 года, чтобы изменить девять из примерно 300 аминокислот белка. При срабатывании света этот новый биоинженерный белок теперь открывает канал, выстланный более положительно заряженными аминокислотами, и тем самым привлекает поток отрицательных (хлоридных) ионов для подавления активности. Это создало микробный опсин, способный оказывать мощный канальный эффект для ингибирования.
Наконец, выполнив одну из самых ожидаемых целей проекта, они изменили 10-ю аминокислоту, что дало им возможность держать этот новый отрицательный канал открытым, делая отрицательный канал более похожим на положительный. Как и предполагалось, это привело к созданию гораздо более светочувствительного ингибирующего канала опсина. Целевые нейроны оставались выключенными в течение нескольких минут после одиночного короткого синего светового импульса таким образом, который мгновенно становился обратимым с помощью красного света. Деиссерот назвал этот новый отрицательный канал опсином SwiChR.
Поскольку команда Стэнфордского университета продолжает 10-летний путь, начатый с первых экспериментов с микробным опсином в нейронах, Дейссерот ожидает, что длительные и стабильные реакции SwiChR откроют новые области возможностей для оптогенетики.
Его энтузиазм был поддержан Мерабом Кокайей, доктором философии, профессором университетской больницы Лунда в Швеции, который использовал оптогенетику для изучения эпилепсии, среди других состояний, на моделях грызунов. Кокайя, который не участвовал в новом исследовании группы Деиссерота, отметил основные преимущества нового опсина: более эффективное подавление нейрональной активности на основе хлоридной проводимости, большая чувствительность к свету и способность оставаться открытым в течение более длительных периодов времени и поддерживать ингибирование даже без свет на более длительные периоды.
"Эти функции могут быть гораздо более полезными для поведенческих исследований на животных, но также могут стать эффективной альтернативой лечения неврологических состояний, при которых лекарства не работают, например, в некоторых случаях тяжелой эпилепсии и других расстройств повышенной возбудимости," Кокая сказал. "Новый подход к инженерии каналов, используемый лабораторией Дайссерота, открывает беспрецедентные перспективы для разработки новых оптогенетических инструментов для исследований системной нейробиологии, которые помогут нам лучше понять, как работает мозг."
Чару Рамакришнан, научный сотрудник лаборатории Deisseroth, также был соавтором статьи.