CRISPR / Cas9, мощный инструмент редактирования генома, обещает эффективную коррекцию болезнетворных мутаций. Впервые исследователи из Медицинской школы Перельмана при Пенсильванском университете разработали подход двойной генной терапии для доставки ключевых компонентов системы нацеливания генов, опосредованной CRISPR / Cas9, мышам для лечения гемофилии B. Это нарушение также называется дефицитом фактора IX и вызвано отсутствием или дефектом белка свертывания. Их исследования будут представлены на 58-й ежегодной встрече и выставке Американского общества гематологов в Сан-Диего с 3 по 6 декабря (Реферат № 1174).
Большинство заболеваний с одним геном, таких как гемофилия, вызваны различными мутациями, разбросанными в конкретном гене, а не одной преобладающей мутацией, поэтому команде нужно было разработать вектор, который был бы применим для пациентов с любыми мутациями. Исследование является доклиническим доказательством концепции использования универсального подхода к нацеливанию на гены CRISPR / Cas9, который может быть применен к большинству пациентов с конкретным заболеванием, в данном случае гемофилией B. По данным Центров по контролю и профилактике заболеваний, гемофилия в целом встречается примерно у 1 из 5000 живорождений, а в США около 20000 человек страдают гемофилией.
"В основном мы вылечили мышей," сказал первый автор Лили Ван, доктор философии, доцент-исследователь Программы генной терапии Пенсильвании (GTP). Джеймс М. Уилсон, доктор медицинских наук, профессор медицины и директор GTP, является старшим автором исследования.
Чтобы проверить этот новый подход, команда провела эксперимент на модели мыши, в которой фактор свертывания IX был нокаутирован. Они использовали двухвекторный подход с вектором 1, экспрессирующим ген SaCas9, управляемый специфическим для печени промотором, так что механизм редактирования генов находится в печени, естественном участке, который производит фактор свертывания крови IX. Вектор 2 – это то, что отличает это исследование от предыдущих исследований генотерапии на основе CRISPR в программе Penn Gene Therapy Program. Вектор 2 содержит последовательность РНК, которая конкретно нацелена на область на 5-первичном конце экзона 2 гена фактора IX мыши и частичную последовательность кДНК фактора IX человека, что придает этому подходу большую эффективность и точность.
Команда использовала аденоассоциированные вирусные векторы для доставки этих компонентов в клетки печени мыши. Разработанная ими стратегия основана на CRISPR-опосредованной гомологичной рекомбинации для вставки кДНК человека в место фактора IX в геноме мыши.
"Нацеленная вставка приводит к экспрессии химерного гиперактивного белка фактора IX под контролем нативного промотора фактора IX мыши," Ван сказал.
Инъекция двух векторов с возрастающими дозами новорожденным и взрослым нокаутным мышам показала стабильную активность фактора IX на уровне или выше нормальных уровней в течение четырех месяцев. Через восемь недель после обработки вектором подгруппе новорожденных и взрослых мышей, получавших нокаут, частично удалили печень, и все они пережили процедуру без каких-либо осложнений или вмешательств и продолжали экспрессировать фактор IX на аналогичных уровнях.
"Это исследование предоставляет убедительные доказательства эффективности на модели мыши с гемофилией B после редактирования генома in vivo с помощью CRISPR / Cas9," Ван сказал. Ян Ян, доктор философии, приглашенный научный сотрудник лаборатории Вильсона, и Джон Уайт, МакМенамин Дейдре и Питер Белл, доктор философии, все из Пенсильвании, также являются соавторами.