Новый подход к редактированию генов с использованием системы CRISPR / Cas9 позволяет обходить вызывающие болезнь мутации в гене, обеспечивая лечение генетических заболеваний, связанных с одним геном, таких как муковисцидоз, определенные типы серповидно-клеточной анемии и другие редкие заболевания. Метод, разработанный и испытанный на мышах и культурах тканей человека исследователями из Пенсильванского университета, включает в себя вставку новой, полностью функциональной копии гена, заменяющего мутировавший ген.
Доказательство концепции этого подхода описано в статье, опубликованной 20 апреля в журнале Molecular Therapy.
Система CRISPR / Cas9 позволила предложить новые многообещающие методы лечения генов, которые могут нацеливать и исправлять вызывающие заболевание мутации в гене. В этом процессе Cas9 – бактериальный белок – разрезает ДНК в определенном месте, где затем можно редактировать, обрезать генетическую последовательность или вставлять новую последовательность до того, как ДНК будет восстановлена. Однако есть два основных ограничения текущих стратегий ремонта. Во-первых, общая стратегия репарации, называемая гомологически направленной репарацией, требует использования определенных белков внутри клетки, которые присутствуют только во время деления клетки, что означает, что процесс репарации генов не может быть использован в большинстве взрослых тканей, где деление клеток происходит редко.
"Вторая проблема проистекает из того факта, что даже когда болезнь вызвана одним геном, она может быть результатом множества различных мутаций в этом гене," сказал Дуглас Кавенер, профессор биологии Университета Пенсильвании и старший автор статьи. "При восстановлении, направленном на гомологию, нам нужно будет разработать и протестировать стратегию для каждой из этих мутаций, что может быть дорогостоящим и трудоемким. В этом исследовании мы разработали подход, называемый «восстановление обхода кооптации регуляции» (CRBR), который можно использовать как для делящихся, так и для неделящихся клеток и тканей, а также для спектра мутаций в гене. Этот подход особенно перспективен для редких генетических заболеваний, вызванных одним геном, где ограниченное время и ресурсы обычно не позволяют разработать и протестировать множество возможных мутаций, вызывающих болезнь."
CRBR использует преимущества системы CRISPR / Cas9 и пути репарации клеток, называемого негомологичным соединением концов, для вставки генетической последовательности между промоторной областью мутированного гена – генетической последовательностью, которая контролирует, когда и где ген функционирует, и мутированной частью ген. Вновь вставленная последовательность содержит конденсированную версию нормального гена, который используется вместо мутированной версии. Терминаторная последовательность в конце вставленной последовательности предотвращает использование оставшегося нижестоящего мутированного гена. Поскольку CRBR не зависит от белков, необходимых для гомологически направленной репарации, его можно использовать во всех типах взрослых тканей.
"Наш подход кооптирует нативный промотор для гена," сказал Цзинцзе Ху, аспирант Пенсильванского университета и первый автор статьи. "Это означает, что вновь вставленный ген будет экспрессироваться в то же время и на соответствующих уровнях внутри клетки, что и ген, который он заменяет. Это преимущество по сравнению с другими типами генной терапии, которые полагаются на внешний промотор для управления высокими уровнями экспрессии гена, что может привести к негативным эффектам, если будет произведено слишком много гена или если при определенных физиологических условиях отсутствует существенная регулирующая реакция."
Исследовательская группа провела серию экспериментов по проверке концепции, чтобы продемонстрировать полезность этого метода. Сначала они сосредоточились на гене PERK, мутации в котором могут привести к редкому заболеванию, называемому синдромом Вулкотта-Раллисона. Синдром возникает, когда копии гена, унаследованного от обоих родителей, имеют мутации – это "рецессивный" болезнь – и может вызвать неонатальный диабет, проблемы со скелетом, задержку роста и другие симптомы.
Исследователи вставили ген PERK в здоровых мышей с помощью CRBR и скрестили их с мышами, у которых была мутация в гене. Полученные мыши, которые содержали один отредактированный CRBR ген PERK и один мутантный ген PERK, не имели типичных аномалий, связанных с синдромом, что указывает на то, что отредактированный CRBR ген может восстанавливать функцию гена PERK в мышиной модели Wolcott-Rallison. синдром.
Затем исследователи протестировали метод CRBR на тканях человека в лаборатории, в данном случае сосредоточив внимание на гене инсулина. Они вставили последовательность гена маркера зеленого флуоресцентного белка между промотором гена инсулина и кодирующей последовательностью инсулина в клетки трупа человека. Этот эксперимент привел к экспрессии флуоресцентного белка в секретирующих инсулин клетках, но не в клетках других типов, что предполагает, что новая последовательность строго регулируется под контролем промотора инсулина.
"Наши результаты продемонстрировали, что репарация гена CRBR может восстановить функцию гена PERK у мышей, и показали потенциальную полезность CRBR для репарации гена в тканях человека," сказал Ху.
Исследователи отмечают, что редактирование генов с помощью CRISPR / Cas9 может быть подвержено ошибкам. Например, стратегии, основанные на гомологически направленной репарации, могут потенциально приводить к повреждающим мутациям в кодирующей последовательности, если репарация не происходит должным образом. С помощью CRBR исследователи нацелены на вставку в область гена, которая не кодирует белок, что должно быть более терпимым к этим ошибкам.
"Генные терапии, такие как CRBR, которые используют CRISPR / Cas9, продолжают сталкиваться с проблемой доставки механизмов восстановления в интересующие клетки," сказал Кавенер. "Одним из многообещающих разработок является выделение клеток или тканей больного пациента, восстановление мутантного гена в лаборатории, а затем трансплантация восстановленных клеток или тканей обратно пациенту. Мы надеемся, что по мере того, как исследователи продолжают совершенствовать методы доставки, CRBR можно использовать для лечения синдрома Вулкотта-Раллисона, а также других генетических заболеваний человека."